固定は組織処理の基礎であり、組織学の顕微鏡検査のために生物学的サンプルを準備するために不可欠です。 この重要なプロセスは、組織構造を保存し、劣化を防ぎ、細胞および分子の特徴の詳細な分析を可能にし、医学研究と診断の進歩を推進します。 あなたが検査技師、生物医学研究者、または病理学者であるかどうかにかかわらず、固定技術とベストプラクティスを習得することは、高品質の結果を達成するために不可欠です。 この包括的なガイドでは、固定に伴うもの、その目的、使用される固定剤の種類、および主要なプロトコルとタイミングの考慮事項について説明します。 組織学における成功した固定の秘密を解き明かすために読んでください。
固定は組織処理の最初のステップであり、固定剤として知られる化学的または物理的薬剤を新鮮な生物学的サンプルに適用して、その構造と組成を保存します。 患者や実験動物から収集された新鮮な組織は、内因性酵素が細胞成分を分解する自己分解と、細菌が分解を引き起こす腐敗を起こしやすい傾向があります。 固定は、タンパク質、脂質、およびその他の細胞要素を安定化し、生体内条件に可能な限り近い状態を維持することにより、これらの分解プロセスを停止します。 この保存は、脱水、クリアリング、浸透、埋め込みなどの後続のステップで重要です。これらのステップは、組織を薄いセクショニングと顕微鏡分析に備えます。 腐敗と組織の硬化を阻止することにより、固定により、研究者と臨床医は細胞の詳細を研究し、病気を診断し、正確かつ信頼性をもって生物医学を進歩させることができます。
固定は、組織学において複数の重要な機能を果たし、品質の結果を確実にするための単純な保存を超えています。 タンパク質を架橋することで組織の3次元構造を安定させ、後の処理段階での崩壊や歪みを防ぎます。これは、顕微鏡で細胞の形態を観察するために不可欠です。 このプロセスはまた、自己溶解と細菌の増殖を阻害し、重要な特徴を覆い隠す可能性のある酵素的および微生物的分解から組織を保護します。 さらに、固定は組織の硬度を高め、サンプルの取り扱いを容易にし、ミクロトミーを介して薄く一貫した切片に切断します。 もう1つの重要な役割は、化学反応性を維持することです。これにより、ヘマトキシリンやエオシン (H & E) などの特定の染色技術が、分析のために細胞構造または分子を強調することができます。 効果的な固定がないと、組織が劣化し、組織学的研究と診断結果の信頼性が損なわれるため、このステップは組織学のワークフローに不可欠です。
組織学ではさまざまな固定剤が使用されており、それぞれが特定の組織、研究目標、または診断のニーズに合わせた異なる特性を備えています。 固定液の選択は、保存品質、染色適合性、および下流分析に直接影響します。 以下では、組織処理で使用される最も一般的なタイプを探ります。
10% 中性緩衝ホルムアルデヒド溶液であるホルマリンは、組織学のゴールドスタンダードです。 組織に効果的に浸透し、タンパク質を架橋して構造を保存し、さまざまな汚れとうまく機能するため、日常的な医療や研究の用途に最適です。 そのリン酸緩衝は、組織に害を及ぼす可能性のあるpHシフトを防ぎ、パラフィンが埋め込まれたセクションで一貫した結果を保証します。 ただし、長時間の曝露は組織を過度に硬化させる可能性があるため、慎重なタイミングが不可欠です。
70% エタノールやカルノイ溶液 (エタノール、クロロホルム、酢酸のブレンド) などのアルコール固定剤は、グリコーゲンなどの特定の成分の迅速な浸透と保存で高く評価されています。 エタノールは小さくて繊細なサンプルに適していますが、カーノイは分子研究で人気のある核酸の固定に優れています。 これらの固定剤も組織を脱水しますが、過剰固定はサンプルを収縮または脆くする可能性があり、綿密な監視が必要です。
強力な架橋剤であるグルタルアルデヒドは、超微細構造の優れた保存のために電子顕微鏡で広く使用されています。 タンパク質と脂質は非常によく固定されますが、浸透が遅く、一部の汚れを妨げる可能性があり、余分なものを取り除くために長時間の洗浄が必要になるため、通常の組織学ではあまり一般的ではありません。 他の選択肢には、ピクリン酸、ホルマリン、酢酸を組み合わせたブイン溶液が含まれます。これは、胚や精巣などの軟組織に優れていますが、DNAを分解する可能性があります。 B-5のような塩化水銀ベースの固定剤は、血液学的サンプルに鋭い核の詳細を提供しますが、安全性の懸念から毒性があり、あまり使用されていません。 凍結乾燥や熱固定などの物理的方法は、特殊なケースに役立ちますが、化学固定剤が組織学を支配します。 適切な固定剤の選択は、組織の種類、研究目標、および亜種との互換性に依存しますQuentステップ。
効果的な固定には、組織の品質を損なうことなく最適な保存を達成するために、適切に設計されたプロトコルと正確なタイミングが必要です。 プロトコルは、組織の種類、サイズ、固定剤の選択、および意図された分析に基づいて異なりますが、タイミングは浸透と化学反応のバランスを取ります。 固定を成功させるための重要な考慮事項とベストプラクティスは次のとおりです。
即時固定: 自己溶解を防ぐために、収集後すぐに固定を開始します。 完全な浸透を確保するために、最初から構造を保存するために重要な、10:1の固定液対組織体積比で10% 中性緩衝ホルマリンのような固定液に組織を水没させます。
調整されたタイミング: 厚さ4mm未満の生検などの小さなサンプルは6〜12時間で適切に固定される可能性がありますが、臓器などの大きな標本は24時間以上必要です。 固定下では組織が柔らかくなり、分解しやすくなりますが、ホルマリンまたはグルタルアルデヒドによる過剰固定は硬化し、染色親和性が低下する可能性があります。
温度制御: 効果的で安全なため、ほとんどの場合、室温 (20〜25 °C) で固定を実施します。 37 °Cなどの穏やかな加熱は、高密度の組織への浸透を速めることができますが、繊細な構造への損傷や歪みを防ぐために過度の熱を避けます。
プロセッサ統合: 自動化ティッシュ処理装置多くの場合、最初のステーションとして固定ステップが含まれ、複数のサンプルを処理するラボのワークフローを合理化します。 これらを使用して、特にホルマリン固定組織の日常的な組織学で一貫性を維持します。
サンプルの準備: 特に脳や乳房などの高密度または脂肪の多いサンプルの場合、より良い固定浸透のために組織を4〜5mmの厚さにトリミングします。 プロセッサの攪拌または真空サイクルは、浸透を促進し、品質を犠牲にすることなく固定時間を短縮できます。
特殊なプロトコル: 電子顕微鏡の場合、2.5% グルタルアルデヒドを2〜6時間使用し、続いて緩衝液洗浄を行って超微細構造を保存します。 分子研究の場合、カーノイまたはエタノールによる迅速な固定 (1〜2時間) はDNAとRNAを保護し、遺伝子分析のニーズに適しています。
固定後の取り扱い: 固定後、必要に応じて組織を解剖して埋め込み用の領域を選択し、処理のためにラベル付きカセットに配置します。 これにより、下流のセクショニングと分析の正確な追跡と位置合わせが保証されます。
安全性と文書化: 実験室の職員を保護するために、特に塩化水銀のような有毒な固定剤を使用して、安全ガイドラインを遵守してください。 ドキュメントの固定時間、固定タイプ、および一貫性を監視し、問題のトラブルシューティングを行い、信頼性の高い結果を保証します。
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